肝腫瘤；乙型肝炎病毒；X基因中國圖書館分類號R735.7 Subject headings liver neoplasms; hepatitis B virus; X gene目前公認肝癌(HCC)的發病是多因素協同作用的結果，其中乙肝病毒(HBV)感染是HCC的主要病因之一.流行病學調查表明HBV感染者HCC的發病率較對照人群高出200倍以上.雖然HBV的確切致癌機制尚未完全闡明，但隨著分子病毒學的研究進展，人們對HBV X基因及其產物X蛋白(pX)與HCC之間的關系已有了多方面及多層次的了解，積累了大量研究資料. HBV基因組是一不全雙鏈的環狀DNA分子，其長鏈含有4個開放讀碼框架(ORF)，分別為編碼前S1蛋白，前S2蛋白及S蛋白的S基因，編碼前C蛋白與C蛋白的C基因，編碼DNA聚合酶蛋白的P基因，以及編碼pX的X基因.X基因是HBV DNA中最小的一個ORF，編碼基因區位於1374～1818核苷酸之間，其編碼的pX(或稱為乙肝病毒X抗原，HBxAg)由154個氨基酸組成.Kwee et al[1]研究表明X基因至少編碼Mr 17000，8000和6600三種蛋白，基因分析顯示靠近5＇的AUG起始密碼開始的序列表達完整長度的Mr 17000蛋白，即pX.Mr8000和Mr 6600兩種蛋白是由框架內起始密碼子編碼的兩種缺失氨基端部分序列的pX.三種蛋白在調控中的作用有所不同，只有Mr17000 pX能激活NF-kB依賴性啟動子序列，而對SV40的增強子/啟動子序列的轉錄激活，Mr17000和Mr6600蛋白均為必需.可見X基因編碼的三種蛋白在功能上互相聯系，具有多種轉錄調節活性. 1X基因的轉染與轉基因研究X基因的轉染與轉基因研究使人們對X基因的致癌作用有了突破性認識.1989年Shirakata et al首先發現通過X基因片段的表達載體轉染小鼠成纖維細胞系NIH3T3誘發其體外轉化，經裸鼠移植可在裸鼠體內形成腫瘤.其後Luber et al[2]應用X基因轉染小鼠肝細胞系FMH202，發現所有轉染成功的細胞克隆在軟瓊脂培養中出現惡性生長，形成的細胞集落移植到裸鼠後形成瘤灶.作者認為X基因的表達及肝細胞的基因突變是導致HCC發生的主要原因.X基因轉基因研究中最引人關注的是Koike et al[3]將X基因導入CD-1小鼠系的胚胎細胞中，誘發84%的雄鼠肝髒腫瘤並伴有pX的高度表達.實驗小鼠在2月齡時圍繞中央靜脈周圍的肝細胞出現胞質空泡樣變，伴有pX的高度表達，13月齡時小鼠出現癌灶.經5-溴脫氧尿核苷標記分析，病灶中肝細胞DNA的合成較對照明顯增加，且DNA含量分析顯示在癌灶出現前轉基因鼠的肝髒存在數個非整倍體峰.轉基因鼠的研究為X基因在HCC發病中的作用提供了直接的證據. 然而，並非所有的轉基因研究均能誘發惡性轉化.Reifenberg et al[4]將X基因導入C57B/6J小鼠的胚胎中，經長達2a的觀察後處死小鼠，組織學檢查顯示轉基因小鼠的肝髒雖有X基因表達，但病理改變輕微，並無HCC的發生.Balsano et al[5]的研究同樣未能在轉基因鼠中誘發HCC.對此，Koike[6] 認為能否在轉基因鼠中誘發HCC的關鍵是pX的持續高水平表達，而僅低水平的pX表達不足以導致HCC的發生. 2 X基因的反式激活作用1987年Twu et al發現與PUC 9重組的X基因在猴腎細胞中可激活人β-干擾素基因的調控序列，使受此調控序列調控的氯霉素乙酰轉移酶轉錄增加，從而揭開了X基因反式激活作用研究的序幕.現已明確X基因的反式激活作用具有明顯廣譜性，pX作為一非特異性反式激活因子，對多種細胞與病毒的多種靶基因均具有反式激活作用[7，8].目前已知pX對多種癌基因具有反式激活作用，其中包括c-myc，ras,c-fos及c-jun等.此外，pX亦能激活胰島素樣生長因子受體Ⅰ，Ⅱ[16,17]及多藥耐藥基因.因此，人們有理由相信X基因通過其反式激活作用改變宿主基因的表達，導致HCC的發生.pX的反式激活機制非常復雜，主要是以細胞因子作為橋梁，通過復雜的信號傳導間接發揮其廣譜轉錄激活功能.與pX反式激活有關的細胞因子有AP-1，AP-2，NF-kB,EF-C及ATF/CREB等.目前已知pX可引起內源性蛋白激酶C(PKC)活性物質DAG增加，激活PKC後引起AP-1，AP-2及NF-kB等細胞因子活化，從而對靶序列發揮激活作用[9].另一方面，pX亦可通過激活Ras-Raf-MAP激酶鏈鎖反應，引起AP-1及NF-kB活化，繼而發揮轉錄激活作用[10].此外，亦有研究顯示pX可直接作用於核內組分引發轉錄激活[11]，或者與細胞內蛋白酶、蛋白酶復合物組分[12]抑或DNA修復蛋白[13]發生作用，從而發揮其反式激活作用.由此可見pX的反式激活存在多種途徑與方式.Arii et al[14]對pX的一級結構進行分析，發現pX的反式激活功能需要三個關鍵部位；第46～52氨基酸(特別是46脯氨酸、49組氨酸與52組氨酸)、第61～69氨基酸(特別是61半胱氨酸、67甘氨酸、68脯氨酸與69半胱氨酸)，以及第132～139氨基酸(特別是132苯丙氨酸、137半胱氨酸與139組氨酸)，這三段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守.第46～52氨基酸是形成組氨酸/天冬氨酸特征性功能結構所必需，而第61～69氨基酸及第132～139氨基酸則與絲氨酸蛋白酶抑制有關的Kunitz區域類似，通過此相似結構pX可直接抑制絲氨酸蛋白酶，從而阻斷絲氨酸蛋白酶的作用[15].因此，這兩種功能結構對pX的反式激活功能至關重要，而第5～27氨基酸及第144～154氨基酸的缺失並不影響pX的反式激活功能.雖然目前對pX反式激活的途徑及功能結構有所了解，但由於其作用機制的復雜性，人們尚缺乏統一的認識. 3 X基因與p53基因p53基因是一種腫瘤抑制基因，野生型p53具有維持細胞正常生長，抑制細胞惡性轉化的作用.當細胞因物理或化學因素作用發生DNA損傷時，可通過p53啟動細胞凋亡過程，使有癌變傾向的細胞不再存活.p53基因的丟失或突變失活不但使其失去野生型p53的作用，而且可能具有癌基因的功能.1991年Hsu et al與Bressac et al分別報道了中國啟東和南非地區的HCC，發現在p53的249編碼區第三密碼子有一特征性點突變G→T顛換(249ser)，使原先的精氨酸被絲氨酸所代替，其突變率高達50%，這一結果曾被視為肝癌與p53關系研究中的重大突破.但隨後的研究表明此特征性G→T顛換主要由黃曲霉毒素B1引發，而與是否存在HBV感染關系甚微[16].此外，與HCC有關的p53突變尚有249met及220cys[17]，但似與HBV感染的聯系並不密切.在HBV與p53基因關系研究中引人注目的結果是發現了pX有與P53蛋白結合的作用[18].由於pX與P53蛋白的結合可在蛋白水平使靶細胞中抑癌基因及其產物的功能發生改變，破壞了p53基因的負調節作用，從而導致細胞的惡性轉化[19，20].現已證實pX能有效阻斷p53介導的細胞凋亡[21]，其機制可能為通過p53功能的喪失，抑或干擾阻斷p53與TBP亞基TFIIH及p62亞基TFIID的聯系[22].Ghebranious et al[23]通過p53 246ser突變的轉基因鼠與表達HBV的轉基因鼠進行繁殖，並應用黃曲霉毒素B1作用於後代，結果顯示13月齡的p53異常伴有HBV轉基因小鼠的HCC發生率高達62%～100%，遠較單純p53突變或HBV轉基因小鼠的癌變率高，提示p53突變，HBV感染與黃曲霉毒素在HCC發病中有重要作用.然而，Oguey et al[24]對鼠肝細胞系AML12進行X基因與p53 246ser突變基因的共轉染研究，結果並未發現明顯的惡性轉化，這或許與AML12細胞系對p53突變及pX的作用不甚敏感有關. 4 X基因與pX的表達 HBV DNA整合入宿主細胞基因組是HCC遺傳學研究的重大發現之一.目前已知在HBV慢性感染的病程中，HBV DNA以低頻率隨機地整合入肝細胞基因組，在進行整合的同時常伴隨宿主DNA的缺失、重排與轉位，最終引起染色體畸變或結構異常[25].在宿主肝細胞基因組，HBV DNA的整合部位不是單一的，它們隨機地分布於多條染色體上.然而，統計分析表明這種整合多發生在HBV基因組的X基因區域，因此X基因及其產物pX的表達研究引人注目.在肝癌組織中，X基因與pX表達的陽性率約為50%～90%[26，27].pX主要位於胞質內，部分位於胞核內，且癌周組織的陽性率與癌內相近，但pX在肝癌的表達遠較乙肝後肝硬變及慢性乙肝為高，在分離培養的人肝癌細胞仍保持表達pX的特性.此外，約有40%～60%表達X基因或pX的肝癌，其HBsAg的表達為陰性[28] ，提示部分血清HBsAg陰性患者其肝癌組織中仍有X基因的整合.pX在肝癌的表達亦常伴有p53的突變[29].由於X基因的整合與pX的表達既可見於癌細胞，也可見於部分尚無明顯癌變的肝細胞或無症狀HBV攜帶者的肝細胞中，因此整合本身僅可能為致癌的起始因素.通過整合可使DNA結構異常，在有輔助致癌因素的作用下可啟動癌基因的調節順序，或通過X基因的反式激活作用，使癌基因轉錄活性增強而最終導致肝細胞惡性轉化.有鑒於此，有學者認為pX的表達可視為HCC發生的先兆.有關pX的血清學檢測研究顯示無論在HCC抑或慢性乙肝患者的血清中，pX的檢出率均較其他乙肝標志物為低，僅為10%～20%[30].這可能因pX是一個弱抗原，或者pX僅在細胞融解時才被釋放，因此肝癌細胞內pX表達率與血清pX檢出率不呈平行關系.HCC的流行病學調查與實驗研究均表明HBV在HCC的發病中具有重要作用.然而，可長達30a的潛伏期也顯示HCC的發生是一個多步驟過程.雖然目前已知HBV X基因和pX與肝癌的關系密切，但迄今為止還有許多問題需要進一步研究，這包括X基因的反式激活機制，與宿主肝細胞DNA的整合以及與p53基因的關系等.有理由相信隨著X基因的深入研究，將會大大促進肝癌的防治水平.
